1)冰凍切片制備:建議用新鮮組織,否則組織細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞,易使抗原彌散。選用干凈鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等,防止裂片和脫片。
2)組織切片固定:切好片風(fēng)干后立即用冰丙酮等固定液進行固定5-10min,尤其要較長時間保存的白片,一定要及時固定和適當(dāng)保存。
3)血清封閉:為防止內(nèi)源性非特異性蛋白抗原的結(jié)合,需要在一抗孵育前先用血清(與二抗來源一致)封閉,減弱背景著色。血清封閉的時間是可以調(diào)整的,一般10-30min。
4)一抗孵育條件:在免疫組化反應(yīng)中最重要,包括孵育時間和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種:4度、室溫、37度,其中4度效果更佳;孵育時間:這與溫度、抗體濃度有關(guān),一般37度1-2h,4度過夜(從冰箱拿出后37度復(fù)溫45min)。具體條件還要摸索。
5)二抗孵育條件:一般室溫或37度30min-1h,具體時間需要摸索,而濃度一般有工作液,若是濃縮液還要摸索濃度,一定要避光反應(yīng)。但在免疫熒光中我們一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r間先定下,然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r間。最后,熒光素標(biāo)記的二抗隨著保存時間的延長,可能會有大量的游離熒光素殘留,需要注意配制時小包裝和并進行適當(dāng)?shù)碾x心。
6)復(fù)染:目的是形成細胞輪廓,從而更好地對目標(biāo)蛋白進行定位。一般常用DAPI復(fù)染。
7)封片:為了長期保存,我們一般用緩沖甘油等封片,此外還有專門的抗熒光萃滅封片液。避免產(chǎn)生氣泡,方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液,然后一手拿住蓋片某一拐角,而另一手拿對面的那個拐角,接近封片液近端的拐角先降低,直至接觸到液體時為止;當(dāng)發(fā)現(xiàn)液體接觸面在不斷彌散時,則可以緩慢降低另一拐角,這樣一般不會產(chǎn)生氣泡。
8)切片清洗:為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色,所以適當(dāng)?shù)丶訌娗逑?延長時間和增多次數(shù))尤為重要,一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次,而一抗孵育后的清洗均為5次*5min。
注意：(1)單獨沖洗,防止交叉反應(yīng)造成污染。(2)溫柔沖洗,防止切片的脫落。我喜歡用浸洗方式;(3)沖洗的時間要足夠,才能徹底洗去結(jié)合的物質(zhì)。
9)PBS的PH和離子強度的使用和要求(建議PH在7.4-7.6,濃度是0.01M;中性及弱堿性條件有利于免疫復(fù)合物的形成,而酸性條件則有利于分解;低離子強度有利于免疫復(fù)合物的形成,而高離子強度則有利于分解) (5)拍照:有條件的話更好立即拍照,若不能及時拍照,也要封好片和用指甲油封固,保持避光和濕度。使用熒光顯微鏡注意嚴(yán)格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進行操作,不要隨意改變程序;應(yīng)在暗室中進行檢查;防止紫外線對眼睛的損害,在調(diào)整光源時應(yīng)戴上防護眼鏡;檢查時間每次以1~2h為宜,超過90min,超高壓汞燈發(fā)光強度逐漸下降,熒光減弱;標(biāo)本受紫外線照射3~5min后,熒光也明顯減弱或褪色;激發(fā)光長時間的照射,會發(fā)生熒光的衰減和淬滅現(xiàn)象;所以最多不得超過2~3h;熒光顯微鏡光源壽命有限,標(biāo)本應(yīng)集中檢查,以節(jié)省時間,保護光源。天熱時,應(yīng)加電扇散熱降溫,新?lián)Q燈泡應(yīng)從開始就記錄使用時間。燈熄滅后欲再啟用時,須待燈光充分冷卻后才能點燃。中應(yīng)避免數(shù)次點燃光源。關(guān)閉汞燈至少在開啟15-30分鐘后;標(biāo)本染色后立即觀察,因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標(biāo)本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存,可延緩熒光減弱時間,防止封裱劑蒸發(fā);使用的玻片等載體,都必須厚度均勻,無明顯的自發(fā)熒光,如果使用油鏡,還必須保證鏡油為無熒光鏡油;電源更好裝穩(wěn)壓器,否則電壓不穩(wěn)不僅會降低汞燈的壽命,也會影響鏡檢的效果。